實時熒光定量PCR技術
實時熒光定量PCR原理
所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數（如圖1所示）。
PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15
研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系〔1〕，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值（如圖2所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：
1）TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術平臺。
2）SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加*同步。
1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，zui終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
實時熒光定量PCR技術
2．內標在傳統定量中的作用
由于傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異（見圖4），因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
編輯本段內標對熒光定量PCR的影響
有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方。
實時熒光定量PCR儀是*的熒光定量PCR的金標準，可實現多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。
綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量zui準確，重現性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
熒光PCR是分子診斷的熱點技術，它將先進的定量PCR與實時PCR技術相結合，國產實時熒光定量PCR儀為肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測提供了先進手段。即使在發達國家，熒光定量PCR儀和基因擴增儀都被廣泛用于臨床及生物學、醫學研究。由于其*的靈敏度、極寬的檢測范圍，以及定量、方便快速、無窗口期等優點，美國FDA及我國已將定量PCR儀規定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測的*儀器。
實時熒光定量PCR儀（real-time qPCR）的發明實現了榮獲諾貝爾化學獎的PCR核酸檢測、分子診斷的技術飛躍。
臨床疾病診斷：
各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優生優育檢測；腫瘤標志物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。
禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。
食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業阪崎腸桿菌等檢測。
醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。
各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。
由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優勢。
標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，并遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應體系中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得CT值，同時利用數個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。
標本載體
0.2ml薄壁PCR離心管
標本數量
標本數量36個，包括4個標準品
試 劑
SYBR Green I，FAM，Tex Red，FITC等熒光染料，開放式PCR試劑
反應體系
10-100μL
建議質控
四個陽性標準品、陰性對照
指標
熒光激發波長
470nm
熒光發射波長
530nm，640nm，710nm
570nm，605nm
熒光檢測方式
光開關陣列組合光電倍增管PMT方式
控溫范圍
4.0℃-99.0℃
熱蓋溫度
100℃～120℃
升/降溫速度
≥4.0℃/S（Max）
溫度均勻性
≤±0.3℃
溫度度
≤±0.3℃
溫度顯示精度
0.1℃
檢測范圍
101～1010DNA/RNA copy/ml
CT值重復性誤差
CV≤2.1％
核酸精度相關系數
R≥0.997
溫階
1～9
循環
1～99
保溫時間
1～9999秒
文件
1～9個連接
升級方式
遠程硬件內控軟件升級
系統接口
RS-232C串行接口，雙向數據
Windows2000/XP
產品外形尺寸
50cm × 40cm × 35cm
產品重量
25kg
使用環境
溫度5～40℃，相對濕度≤80％
使用電源
AC220 × （1±10%）V,50 × （1±2%）HZ
功耗
1100VA
多規格
提供96孔，多通道/多色、36孔等不同規格產品
技術應用實現快速均衡擴增檢測由光開關陣列、自聚焦透鏡和尾纖準直器及變增益微光O/E裝置組成的MEMS有機整體，在以16位單片機為核心的電控裝置管理下，能在毫秒級時間內完成多個標本快速均衡掃描檢測，避免了機械掃描方式或CCD掃描方式引起的時間滯后或漸暈誤差。實現標準樣本的PCR熱循環擴增及高通量實時熒光激發和定量檢測。
產品突出特性
« 走在PCR技術的前列
在PCR儀和市場化領域中歷史悠久；
將標準化的PCR檢測技術成功廣泛用于臨床；
« 快速實時PCR技術實現了DNA/mRNA檢測的快速性
實時檢測啟用熒光探針標記特定核酸的方法使準確性更高；
簡化了傳統PCR方法；
使用zui少的樣本量，在一小時左右出結果；
« 簡便閉管分析使您完成加樣后就無須再接觸樣本
減少樣本消耗殆盡風險；
縮短了出報告時間；
簡化了試驗步驟；
« 提高了用戶應用的靈活性
提供了用戶自定義PCR操作平臺；
建立您的用戶自定義應用；
分析用戶自定義試驗；
« 高性能
高靈敏度；
高特異性；
寬的動態范圍；
« 強大的軟件數據管理系統
完整的病例檔案；
集成化的網絡服務功能；
圖標顯示；
自動試劑及結果跟蹤；
客戶使用界面友好；
« 開放式、個性化儀器易于適應您的實驗室環境
« 免維護光源系統
高亮度窄帶LED光源，工作穩定，使用壽命長，終身免維護
« 靈敏的光電系統
熒光激發/檢測單色器采用美國原產濾光片；檢測器采用日本原產金屬封裝式光電倍增管PMT，具有靈敏度高、快速、穩定的特點；準直器、光開光陣列、光纖組件、電控裝置全部采用進口期間；精度高，一致性好。
« 先進的溫控系統
本儀器采用膜加熱及半導體熱泵制冷技術保證了升降溫的快速穩定、儀器壽命長的特點，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為原因造成的污染。
« 先進的溫控系統
本儀器采用膜加熱及半導體泵制冷技術保證了升降溫的快速穩定、儀器壽命長的特點，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為原因造成的污染。
« 友好的軟件系統
中文Windows傳統界面更符合國人操作習慣，多個標準參數填空式輸入降低了因參數設置所造成的事物；參數輸入提示保證了參數輸入的有效性。
« 多樣化的運行方式
每個程序段數多達9個；每個程序的步驟多達9個；每個程序的循環數多達99個，溫度、循環等多個參數的多種修正、調節方式，可*臨床及科研上試驗的要求。
« 良好的線性范圍、靈敏度、重復性
線性范圍廣、可檢測的樣品濃度線性范圍101～1010，靈敏度zui小分辨率為1拷貝，重復性CV≤2.1%。
« *的瞬時斷電保護功能
瞬時停電后本儀器可提醒用戶繼續試驗。因電網或其他或其他原因造成的短暫瞬時停電不再會給您的實驗帶來麻煩，為您減少試劑的損耗，解除您PCR實驗室沒有專線電源的顧慮。
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